脳由来神経栄養因子(BDNF)は、神経細胞の生存や分化、さらに神経回路の形成や記憶・学習の基盤である神経シナプス可塑性の調節、に関わる重要な分泌性因子です。従って、その分泌異常や機能不全は、うつ病、統合失調症といった神経疾患の原因となることが知られています。BDNFは、神経細胞内で前駆体BDNFとして合成された後、分泌前あるいは分泌後にプロテアーゼにより切断修飾を受けて、成熟体BDNFになります（この過程をプロセシングと呼びます）。これまでに、このBDNFのプロセシングに関わるプロテアーゼはいくつか報告されましたが、プロセシングを調節する仕組みについては十分明らかにされていませんでした。基礎生物学研究所・統合神経生物学研究部門の鈴木亮子研究員と野田昌晴教授らの研究グループは、ニワトリ及びマウスを用いた研究から、 BDNFのプロセシングがSPIG1というタンパクによって制御されていることを明らかにしました。本研究成果は、2014年2月26日に米国神経科学会誌The Journal of Neuroscienceにオンライン掲載されます。

［研究の背景］

　同研究部門では、動物個体の発生過程でおこる網膜内領域特異化の分子機構と、その後の視神経の視覚中枢への領域特異的な神経結合形成の分子機構（図１）を研究してきました。まず、発生期ニワトリ網膜において鼻耳軸（前後軸）、あるいは背腹軸方向の発現量に差のある分子のスクリーニングを行い、網膜内で領域特異的に発現する多数の分子を同定しました (J. Neurobiol.,2004)。この中に、網膜の背耳側の領域の神経節細胞に多く発現するSPIG1という分子を発見しました。SPIG1は、フォリスタチン様ドメイン、プロテアーゼ阻害ドメイン、EF-handモチーフ、および免疫グロブリン様ドメインから成る分泌因子でした。しかし、その生理的役割はこれまで全くわかっていませんでした。

［研究の成果］

　研究グループは、発生期のニワトリ網膜においてSPIG1遺伝子の発現を抑制（ノックダウン）することから、その機能の解明を開始しました。その結果、SPIG1遺伝子をノックダウンすると、網膜から脳の視中枢（視蓋）へ投射する視神経細胞の軸索から、多くの側枝が異所的に生じることがわかりました（図１: 発生１２日目）。正常な発生では、投射の形成過程において、正しい位置で側枝の形成が起こるだけでなく（図１: 発生１４日目）、不適切な側枝は除去され正しい位置に形成された側枝だけが残るリファイメントという現象が起こります。しかし、SPIG1遺伝子をノックダウンすると、このリファイメントも起こらず、間違った場所にシナプスが形成されました（図１：発生１８日目）。

　網膜を構成する細胞をシャーレ上で培養したところ、SPIG1遺伝子をノックダウンした神経節細胞の軸索には、視蓋上で観察されたのと同様に、多くの側枝が形成されました（図２）。成熟体 BDNFが神経軸索の側枝形成を促すことが知られていることから、SPIG1 がBDNFの分泌・プロセシングの過程に関与することが推測されました。そこで、BDNFの働きを抑える遮断抗体(anti-BDNF抗体)を培地に添加したところ、SPIG1遺伝子をノックダウンした神経軸索から形成される側枝は、濃度依存的に減少することがわかりました（図２）。これらの結果から、SPIG1遺伝子の発現を減少させると、神経節細胞から分泌される成熟体BDNFが増加することが示唆されました。

　研究グループは、培養細胞実験および生化学実験により、SPIG1は細胞内で前駆体BDNFと同じ分泌顆粒内に存在すること、SPIG1は前駆体BDNFに高親和性で結合することを明らかにしました。また、神経細胞にBDNFをSPIG1とともに共発現させると、成熟体BDNFの発現が細胞内と細胞外で減少することから、SPIG1は、前駆体BDNFから成熟体BDNFへのプロセシングを抑制することが判りました。つまり、ニワトリの網膜-視蓋投射系で認められたSPIG1遺伝子のノックダウンによる表現型は、視神経軸索内のBDNFのプロセシングが異常をきたし、成熟体BDNFが異常に多く分泌されるようになったためと考えられます。

　研究グループは、マウスにおいても、SPIG1がBDNFのプロセシングの調節に関わっている証拠を見いだしました。マウスの海馬の錐体細胞において、成熟体BDNFは神経スパインの数を増加させることが報告されています。そこで、SPIG1遺伝子欠損マウスの海馬におけるスパインの数を解析したところ、予想通り、野生型と較べて有意に増加していることが判りました。SPIG1遺伝子欠損マウスにおいては、野生型マウスに較べて前駆体BDNFの発現量が減少し、成熟体BDNFの発現量は増加しておりました。また、それに伴いBDNFの受容体であるTrkBの活性化（リン酸化レベル）が亢進しており、その結果、スパインの数が増加したと考えられます（図３）。

［成果の意義］

　本研究により、不明な点が多く残されている脊椎動物における領域特異的神経結合形成のメカニズムおよびスパイン形成のメカニズムの一端が明らかになりました（図４）。BDNFの分泌異常は、統合失調症、うつ病等、様々な精神・神経疾患との関連性から、注目されています。脳内においてBDNFが適切に働く上で、SPIG1がそのプロセシングにおいて重要な調節を行っていることが明らかになりました。

図1．A, 網膜-視蓋投射 におけるSPIG1遺伝子の発現抑制効果

コントロール（対照）におけるニワトリ網膜の背側由来の視神経（左パネル）。神経の軸索は、発生8日目頃から視蓋腹側に侵入し始め、その後、発生12日目頃には、予定ターミナルゾーン（サークルのエリア）で多数の側枝を形成します。発生14日目には、リファイメントにより、明瞭なターミナルゾーンが形成され始め（四角エリア）、最終的に正しい位置に投射が完成します（発生18日目：四角エリア）。下パネル：四角エリアの拡大図。スケールバー：1mm。

SPIG1遺伝子の発現を抑制した背側網膜由来の視神経（右パネル）では、侵入した軸索は、視蓋上で背側に広がると共に、視蓋前側で異所的に側枝を多数形成します（発生12日目：矢頭）。発生が進んでも明確なターミナルゾーンは形成されず、異所的に形成された側枝は発生18日目でもそのまま残ります（発生14、18日目：四角エリア参照）。

B,　Aの視神経投射の模式図　Tz: ターミナルゾーン。

図２．SPIG1遺伝子発現抑制の網膜神経節細胞の軸索側枝形成に与える影響

網膜神経節細胞のSPIG1遺伝子の発現を抑制すると、軸索側枝の数がコントロールに較べ増加します（Aの左端パネル; Bのグラフ）。培地にBDNFの機能を遮断するanti-BDNF抗体を加えると、濃度依存的（anti-BDNF: 0.5, 2.5, 5.0 μg/ml）に軸索側枝の数は減少します（Aの中央パネル３つ）。コントロール抗体（anti-AP抗体）を加えてもSPIG1遺伝子の発現を抑制した軸索側枝数に変化はありません（Aの右端パネル; Bのグラフ）。従ってSPIG1遺伝子の発現抑制により、網膜神経節細胞から分泌される成熟体BDNFの量が増加したと考えられます。軸索の長さは、コントロールと変わりません（Cのグラフ）。スケールバー：10 μm。*P < 0.01, *P < 0.001。

図３. SPIG1遺伝子欠損マウスの海馬における異常

A, 野生型マウス（WT）とSPIG1遺伝子欠損マウス（KO）の海馬におけるBDNFの発現。KOマウスにおいてはWTに較べ、前駆体BDNFの発現量が減少し、一方、成熟体BDNFの発現量は増加します。 ^*P < 0.05。

B, BDNFの受容体TrkBのリン酸化レベル。KOのTrkBのリン酸化レベルは、WTに較べ増加しています。^*P <0.05。

C,　海馬錐体細胞のスパイン。KOマウスにおいてはWTに較べ、スパインの数が増加しています。海馬においてSPIG1は、BDNFのプロセシングを負に制御し、神経スパイン形成を調節していることが示唆されます。一方、樹状突起の長さには差がありませんでした。スケールバー：40 μm。^*P < 0.01。

図４．神経細胞におけるSPIG1の機能的役割

成熟体BDNFは、網膜神経節細胞の軸索側枝形成を誘導することが知られています。SPIG1は、前駆体BDNFに結合することによって、前駆体BDNFから成熟体BDNFへのプロセシングを抑制し、適切な軸索側枝形成を調節していると考えられます。SPIG1遺伝子の発現を抑制すると、前駆体BDNFから成熟体BDNFへのプロセシングが促進され、成熟体BDNFが増加します。その結果、軸索側枝の数が正常時に較べ増加すると考えられます。

 [発表雑誌]

米国神経科学会誌　The Journal of Neuroscience　２０１４年２月２６日号掲載

論文タイトル：SPIG1 Negatively Regulates BDNF Maturation

著者：Ryoko Suzuki, Masahito Matsumoto, Akihiro Fujikawa, Akira Kato, Kazuya Kuboyama, Keisuke Yonehara, Takafumi Shintani , Hiraki Sakuta, Masaharu Noda.

[研究グループ]

本研究は、基礎生物学研究所・統合神経生物学研究部門の野田昌晴教授らの研究グループによって実施されました。

[研究サポート]

本研究の一部は、文部科学省科学研究費助成事業のサポートを受けて行われました。

[本件に関するお問い合わせ先]

基礎生物学研究所 統合神経生物学研究部門

教授: 野田 昌晴 （ノダ マサハル）

TEL: 0564-59-5846（研究室）

E-mail: madon@nibb.ac.jp

URL: http://niwww3.nibb.ac.jp/

[報道担当]

基礎生物学研究所　広報室

TEL: 0564-55-7628

Fax: 0564-55-7597

E-mail: press@nibb.ac.jp