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2016年02月09日
神経膠腫(グリオーマ)治療に向けた新たな創薬戦略:PTPRZ阻害剤の開発

 脳腫瘍の一つ神経膠腫(グリオーマ)は、脳内にもともと存在するグリア細胞がガン化して形成される固形癌です。とくに悪性なグリオーマはグリオブラストーマと呼ばれ、有効な治療法のない難治性疾患です。グリオーマでは、一般にPTPRZという酵素タンパク質の発現が上昇しており、悪性化への関与が指摘されていました。

 今回、基礎生物学研究所 統合神経生物学研究部門の野田昌晴教授、藤川顕寛研究員らは、アスビオファーマ株式会社、岡崎統合バイオサイエンスセンター生体分子機能研究部門および、大阪大学大学院工学研究科 生命先端工学研究室と共同研究を実施し、PTPRZの酵素活性を阻害する化合物開発がグリオーマ治療に有効であることを、培養細胞を用いた実験やラットをモデルとした実験で証明しました。研究チームは、PTPRZの酵素活性を選択的に阻害する低分子化合物SCB4380を初めて取得し、PTPRZの活性阻害によってラット由来のグリオブラストーマ細胞による移植腫瘍の成長が抑制されることを実験的に示しました。

 本研究の成果は、英国時間2016年2月9日にオンライン科学雑誌Scientific Reportsに掲載されます。

 

【背景】

 神経膠腫(グリオーマ)は、脳内にもともと存在するグリア細胞(あるいはグリア前駆細胞)がガン化した固形癌で、脳腫瘍の約2割を占めると言われています。グリオーマは、その悪性度によって4段階に分けられ、最も悪性度の高いグレードIVは膠芽腫(グリオブラストーマ)と呼ばれます。グリオーマに対しては、外科的切除、放射線療法、そして抗ガン剤による化学療法をセットにした標準治療が行われます。悪性度の高いグリオブラストーマは正常な脳組織内にも深く入り込んでおり、多くの場合、外科的には完全に取り除くことは困難です。そのため、残されたガン細胞に対処する放射線と抗ガン剤の治療が行われます。グリオーマの治療で通常用いられるテモゾロミドという抗ガン剤は、その強い細胞毒性でガン細胞に細胞死を誘導しますが、単独では十分な効果が得られず、異なる作用機序を有する新たな治療薬の開発が急務になっています。

 ヒトなどの多細胞生物では、体を構成する多くの細胞が協調することによって生体恒常性が維持されています。そのために多細胞生物では複雑な情報のやり取りを担う細胞内シグナル伝達系が発達しており、その不具合は発ガンリスクの増大につながります。「チロシンリン酸化シグナル」とは、ガン化との関係性が最も早く明らかにされたシグナル伝達系です。チロシンリン酸化は、チロシンキナーゼと呼ばれる酵素群(PTKファミリー)が細胞内タンパク質の中のチロシンというアミノ酸にリン酸基を付加する反応のことです。一方、チロシンホスファターゼ(PTPファミリー)は、このリン酸基を外す(脱リン酸化する)酵素群です。ヒトではPTK及びPTPファミリーに属するタンパク質分子は、それぞれ100種を超えますが、多くのガンでは特定のPTK分子が異常に活性化する変異が生じていることがわかっています。ガン創薬では、こうした異常なPTKを分子標的としたキナーゼ阻害剤が主流であり、乳ガンや白血病などで有効性が示されています。グリオーマにおいてもPTKの異常な活性化が認められてはいますが、これまで臨床試験では明瞭な治療効果を有するPTK標的薬は得られておらず、新たな創薬標的が切望されていました。

 一方、PTKと対をなすPTPですが、PTKの活性化がガン化に繋がることから、その逆反応を担うPTPは、当初はガン化を抑制する分子と思われきました。しかし最近の研究によって、PTP分子の幾つかは、むしろガン化やガンの悪性化を促進するらしいことがわかってきました。グリオーマに関しては、PTPRZという受容体型PTP分子の発現が上昇しており、その発現を抑制するとヒト由来のグリオブラストーマ細胞株の悪性表現型が抑制されるという報告がなされていました。しかし、これまで抗ガン剤の開発を目的としたPTP阻害剤の探索は行われておらず、創薬コンセプトの妥当性を検証する必要がありました。

 

【研究成果】 

 基礎生物学研究所の野田昌晴教授と藤川顕寛研究員を中心とする研究チームは、PTPRZの分子機能や生理機能について長年研究してきました。これまでの成果の一つとして、PTPRZによって脱リン酸化される生理的基質タンパク分子中に基質モチーフ配列を同定し、この配列を有するペプチドを基質に用いたPTPRZの酵素アッセイ系を特許化していました。アスビオファーマ社では、このアッセイ法を用いて阻害剤のハイスループットスクリーニング(HTS)系を構築し、同社の所有する約2万余りの化合物ライブラリーの中から、PTPRZに対して阻害活性を有する化合物の探索を行いました。この初期的HTSで見つかったSCB4380が、PTPRZとその仲間のPTPRGを選択的に阻害することがわかりました(1)。驚いたことにSCB4380は、食品用色素として用いられている赤色2号(アマランス)と同じ化合物でした(補足:赤色2号は赤褐色の粉末固体です。我が国では、合成着色料として食品や化粧品等に使用されていますが、欧米諸国の一部では、食品への使用が禁止されています)。詳細な解析の結果、SCB4380はPTPRZの酵素活性中心に結合して競合的阻害剤として働くことがわかりました(2)。SCB4380は細胞膜を透過できないため、そのまま投与しても細胞内に存在するPTPRZの酵素活性を阻害しませんでした。そこでSCB4380をリポソームと混合して、細胞内に取り込ませたところ、PTPRZのホスファターゼ活性が阻害されることがわかりました。

 グリオーマの実験モデルとしてよく用いられているラット由来のC6グリオブラストーマ細胞の培養液にSCB4380/リポソームを加えたところ、C6細胞の細胞増殖や細胞移動が有意に低下しました(3)。SCB4380/リポソームの効果は、PTPRZの遺伝子発現をノックダウンしたC6細胞では認められないことから、PTPRZに特異的であることが確認されました(3)。また、SCB4380もしくはリポソームを単独で処理しても効果はありませんでした。研究チームはさらに、C6グリオブラストーマ細胞をラット脳内へ移植し、実際に腫瘍を形成する実験モデルでも検証実験を行いました。その結果、SCB4380/リポソームを脳室内投与することによって腫瘍形成が有意に抑制されることがわかりました(4)。

 

【今後の展開】

 本研究の成果は、グリオブラストーマの悪性表現型がPTPRZの働きを阻害することで抑制可能であることを初めて実証したものです。PTPRZの阻害剤には、グリオーマ細胞の細胞増殖や細胞移動を抑制し、腫瘍の増大や正常組織への浸潤を抑える薬理作用があることが判りました。従って現在のグリオーマ治療で用いられているテモゾロミド(ガンの細胞死を誘導する)と併用することによって相乗効果が期待されます。現在、統合神経生物学研究部門の研究チームでは、更なる阻害剤の探索とグリオーマの悪性化に関わるPTPRZのシグナル伝達経路の解明に取り組んでいます。また、ヒト由来のグリオーマ細胞に対するPTPRZ阻害剤の効果を検証する準備を進めているところです。

 

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1: SCB4380PTPRZ阻害活性

代表的なPTPファミリー分子に対するSCB4380の阻害曲線。各PTP分子に対するIC50値を図中に示した。SCB4380は、PTPRZとPTPRGを特に強く阻害することが分かる。

 

 

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2: PTPRZの酵素ドメインに対するSCB4380の結合様式

本研究では、ヒトPTPRZのPTPドメインのX線結晶解析に成功し、その三次元構造を解明した。この構造に対してSCB4380のドッキングシミュレーションを実施し、阻害構造モデルを構築した。このモデルの妥当性は、質量分析やPTPドメインの点変異体などを用いた実験によって確認した。SCB4380は、基質分子を脱リン酸化する、活性部位(黒丸枠)に結合して酵素反応を阻害する。

 

 

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3: SCB4380/リポソーム処理によるC6グリオブラストーマの細胞増殖能と細胞移動能の低下

A, C6グリオブラストーマ細胞(親株細胞、parent)およびPTPRZの発現をノックダウンしたC6細胞(RZ-KD#2)の増殖に対するSCB4380/リポソームの効果。SCB4380はPTPRZを発現するC6細胞の細胞増殖を濃度依存的に抑制するが、PTPRZを発現しないRZ-KD#2には効果がない。* P < 0.05, ** P < 0.01, ## P < 0.01対 親株細胞 (0 µM)。

B, ボイデンチャンバー法による細胞移動能の評価。SCB4380/リポソームはC6細胞の移動を有意に抑制するが、RZ-KD#2の移動には効果が認められない。** P < 0.01, # P < 0.05対 親株細胞。

 

 

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4: SCB4380によるC6グリオブラストーマ細胞の腫瘍形成能の抑制

C6グリオブラストーマ細胞をラット脳内に移植し、SCB4380/リポソーム複合体もしくは溶媒を側脳室に1回/日で投与した。7日後にヘマトキシリン染色によって腫瘍体積を評価した。溶媒だけを注入した対照群と比べて、SCB4380/リポソームを投与した群では有意に腫瘍形成が抑制されている。*P < 0.05。

 

【発表雑誌】

英国オンライン科学誌  Scientific Reports  2016年2月9日掲載

論文タイトル:Small-molecule inhibition of PTPRZ reduces tumor growth in a rat model of glioblastoma

著者:Akihiro Fujikawa, Asako Nagahira, Hajime Sugawara,Kentaro Ishii, Seiichi Imajo, Masahito Matsumoto, Kazuya Kuboyama, Ryoko Suzuki, Naomi Tanga, Masanori Noda, Susumu Uchiyama, Toshiyuki Tomoo, Atsuto Ogata, Makoto Masumura, and Masaharu Noda

 

【研究サポート】

本研究は、科学技術振興機構 研究成果最適展開支援プログラム (A-STEP)、および自然科学研究機構 岡崎統合バイオサイエンスセンター・バイオネクスト共同利用研究の支援を受けて行われました。

 

【本件に関するお問い合わせ先】

基礎生物学研究所 統合神経生物学研究部門

教授: 野田 昌晴  (ノダ マサハル)

TEL: 0564-59-5846  (研究室)

E-mail: madon@nibb.ac.jp

URL: http://niwww3.nibb.ac.jp/

 

【報道担当】

基礎生物学研究所 広報室

TEL: 0564-55-7628

FAX: 0564-55-7597

E-mail: press@nibb.ac.jp