甲殻類のミジンコの仲間は、日照時間や水温などの環境の変化に応じてメスとオスの子供を産み分けることが知られています。この現象は環境依存型性決定と呼ばれます。これまでの研究で、ミジンコ類に昆虫類や甲殻類のホルモンの一種である「幼若ホルモン」を曝露すると環境条件に関係なくオスばかり産むことが報告されていましたが、実際にミジンコの生体内で幼若ホルモンが「性決定因子」として作用しているかは謎でした。今回、岡崎統合バイオサイエンスセンター／基礎生物学研究所／総合研究大学院大学 生命科学研究科 基礎生物学専攻の豊田賢治大学院生および井口泰泉教授らの研究グループは、国立環境研究所、農業生物資源研究所、島根大学、インディアナ大学（米国）、バーミンガム大学（英国）との共同研究により、日長時間に応じてオスとメスを産み分けられる実験系の確立に成功し、この実験系を用いることでオスを産むためには母親ミジンコの生体内で幼若ホルモンが作られる必要があることを見出しました。そして、この幼若ホルモンの合成に関与する複数の因子を同定することにも成功しました。これらの研究成果はJournal of Insect Physiology誌およびBMC Genomics誌に掲載されました。

 

ミジンコの仔虫。左がメス、右がオス。

オスは第一触角（図中の矢印）が長い。

【研究の背景】

　甲殻類のミジンコの仲間は、生息に適した環境下ではメスがメスを産む単為生殖によって繁殖しますが、日照時間の短縮、水温の低下や餌不足といった環境条件の悪化により、オスを産むことが知られています（環境依存型性決定：図１）。この現象は最初の観察記録が残されてから100年以上経っていますが、ミジンコ類がオスとメスを産み分ける仕組みは分かっていませんでした。10年ほど前に、本研究グループや海外の研究グループは、甲殻類や昆虫類で変態を抑えて、成長を促している「幼若ホルモン」をミジンコ類の飼育水に添加することで、環境条件とは関係なくオスを産ませることができることを見つけました（図１）。このことから、ミジンコの体内でも幼若ホルモンが子供のオス決定因子として働いていると考えられるようになりました。しかし、本当にミジンコ生体内で幼若ホルモンがオス決定因子として作用しているのか、またそうだとするならば、どのようなメカニズムによって生体内の幼若ホルモンシグナルが制御されているのかは明らかになっていませんでした。

 

図１：ミジンコの環境依存型性決定と幼若ホルモン投与によるオス誘導

 

【本研究の成果】

　これまでに、ミジンコ類がオスを産む仕組みが明らかになっていなかった大きな理由は、オスとメスを自在に産み分けさせる飼育条件が確立されていなかったことにあります。多くの教科書や科学雑誌でも「ミジンコは環境が悪くなるとオスを産む」と決まり文句のように書かれているのを目にしますが、実験室でミジンコにとっての劣悪な環境条件を再現してみても、ほとんどの場合オスを産ませることはできません。

 

　そこで豊田賢治大学院生らはまず、日本国内を含む世界中で採取されたミジンコ(Daphnia pulex)を集め、それらを様々な飼育条件下（日照時間、水温、餌量、飼育密度）で飼育し、安定してオスを産む系統とその飼育条件を探しました。その結果、海外で採取されたWTN6系統が日照時間に応じてオスとメスを産み分けることを見出しました。WTN6系統は長日条件（1日24時間のうち14時間明、10時間暗）では生涯を通してほぼメスを、逆に短日条件（10時間明、14時間暗）ではオスの子供を産みます（図２）。

 

図２：日長条件に応じてメスとオスを産み分けるWTN6系統

 

　研究グループはこのWTN6系統を用いて、短日（オス誘導）条件下でのみ幼若ホルモン感受期の前に、幼若ホルモン生合成に必要な酵素であるJHAMTの遺伝子発現レベルが増加することを明らかにしました（図３）。この結果は、性決定期直前のJHAMT遺伝子の一過的な発現によって、性決定期に体内の幼若ホルモン濃度が上昇し、子供の性がオスに制御されていることを示しています（Journal of Insect Physiology誌）。

 

図３：メスとオスの誘導条件下におけるJHAMT遺伝子の発現解析

*は統計的に有意差ありで、紫の部分は性決定期を示す。

 

　さらに、性決定期の幼若ホルモン経路にはどのような上流制御因子が関与しているのか明らかにするために、長日（メス誘導）条件と短日（オス誘導）条件で飼育したWTN6系統の網羅的な遺伝子発現解析を、次世代シーケンサを用いたRNA-seqと呼ばれる方法で実施しました。その結果、短日条件においてのみ統計的有意に発現変動している遺伝子としてイオンチャネル型グルタミン酸受容体を見出しました。イオンチャネル型グルタミン酸受容体は、中枢神経系を中心に生体内で広く発現して記憶や学習行動などに関与していることが知られており、NMDA型、AMPA型、Kainate型の3種類のサブタイプに分けることができます。そこで、この3種類の受容体サブタイプに特異的な活性化剤や阻害剤を用いて、どの受容体サブタイプがミジンコのオス誘導に関与しているかを調べました。すると、オス誘導条件下でNMDA型の阻害剤であるMK-801を投与するとほぼ全ての母親個体からメスが産まれること、またAMPA型とKainate型の阻害剤であるNBQXを投与すると若干オスの誘導が阻害されることが分かりました（図４Ａ）。さらに、これら阻害剤と一緒に幼若ホルモンを投与すると全ての個体がオスを産みました（図４Ａ）。また、メス誘導条件下で各受容体サブタイプの活性化剤の投与実験の結果、特にNMDA型の活性化剤であるNMDAを投与すると全ての個体がオスを産みました（図４Ｂ）。これらの結果は、イオンチャネル型グルタミン酸受容体の中でも特にNMDA型受容体が、ミジンコの性決定期における幼若ホルモン経路の上流制御因子であることを示しています（BMC Genomics誌）。

 

図４：イオンチャネル型グルタミン酸受容体の阻害剤と活性化剤がミジンコのオス誘導に与える影響

 (A)オス誘導（短日）条件で阻害剤投与の影響。(B)メス誘導（長日）条件で活性化剤投与の影響。MK-801:NMDA型受容体の阻害剤。NBQX：AMPA型・Kainate型受容体の阻害剤。NMDA, AMPA, Kainate:各受容体の活性化剤。MF:ファルネセン酸メチル（幼若ホルモン）。 *は統計的に有意差ありを示す。

 

【本研究の意義と今後の展望】

　生物を取り巻く自然環境は絶え間なく変動しており、その時々で生き残っていくために多くの生物は有性生殖によって様々な個性を持った子孫を残しています。この種の繁栄を左右する重要な「性」という形質が外部環境によってコントロールされている環境依存型性決定の仕組みは多くの生物学者を魅了してきましたが、未だその多くは謎に包まれています。

本研究では、ミジンコ(Daphnia pulex)のWTN6系統は環境の悪化（短日情報）を感受するとNMDA型のグルタミン酸受容体やJHAMT遺伝子を介して生体内の幼若ホルモン濃度を高め、産まれてくる子供の性をオスに制御しているというモデルを提唱することができました（図５）。

 

図５：本研究の成果から得られた短日条件に応じたミジンコのオス誘導モデル

 

　ミジンコは実験室での飼育や維持が容易で、繁殖周期が短く、卵の時期から顕微鏡下で観察できるなど実験動物として優れた特長を有しています。また、甲殻類で初めて全ゲノム情報が解読されており、ゲノム研究の基盤も整備されています。さらに研究グループはミジンコにおいて特定遺伝子を破壊する方法を既に確立しています(Hiruta et al., 2014)。これらのことから、この研究で確立した日長条件に応じて子供の性を産み分けるWTN6系統は、今後、ミジンコの性決定研究に留まらず、環境依存型性決定を理解する上で優れたモデルになると期待されます。

 

【論文情報】

Journal of Insect Physiology　2015年2月24日掲載

“Methyl farnesoate synthesis is necessary for the environmental sex determination in the water flea Daphnia pulex”

著者：Kenji Toyota, Hitoshi Miyakawa, Chizue Hiruta, Kenjiro Furuta, Yukiko Ogino, Tetsuro Shinoda, Norihisa Tatarazako, Shinichi Miyagawa, Joseph R. Shaw, Taisen Iguchi

 

BMC Genomics　2015年3月14日掲載

“NMDA receptor activation upstream of methyl farnesoate signaling for short day-induced male offspring production in the water flea, Daphnia pulex”

著者：Kenji Toyota, Hitoshi Miyakawa, Katsushi Yamaguchi, Shuji Shigenobu, Yukiko Ogino, Norihisa Tatarazako, Shinichi Miyagawa, Taisen Iguchi

 

【研究サポート】

本研究は、日本学術振興会科学研究費助成事業（科研費）および環境省の支援のもと行われました。豊田賢治大学院生は日本学術振興会の特別研究員(DC1)として本研究に従事しました。

 

【本研究に関するお問い合わせ先】

岡崎統合バイオサイエンスセンター・基礎生物学研究所

分子環境生物学研究部門

総合研究大学院大学 生命科学研究科 基礎生物学専攻

教授　井口 泰泉（イグチ タイセン）

TEL: 0564-59-5235（研究室）

E-mail: taisen@nibb.ac.jp

 

豊田 賢治（トヨタ ケンジ）

TEL: 0564-59-5238（研究室）

E-mail: kenji514@nibb.ac.jp

 

【報道担当】

基礎生物学研究所 広報室

TEL: 0564-55-7628

FAX: 0564-55-7597

E-mail: press@nibb.ac.jp