-文部科学省科学研究費補助金「特定領域研究」細胞核ダイナミクス　堀米　恒好-

細胞核の高次構造動態：ナノスケールイメージングによる解明

研究分担者

堀米　恒好（研究分担者）＜新潟大学・理学部・化学科　教授＞〒950-2181 新潟市五十嵐２の町８０５０ TEL: 025-262-6160 FAX: 025-262-6160 E-mail: thori@sc.niigata-u.ac.jp URL: http://chem.sc.niigata-u.ac.jp/~thori/ ・主な研究内容・研究室メンバー・最近の研究成果・総説・解説等・著書


	ISP36はSC35(interchromatin granule cluster成分)と同じクロマチン間コンパートメントに存在する。マウスC3H細胞を抗ISP36抗体（赤）と抗SC35抗体（緑）で染色すると細胞核が染色された。SC35の染色はISP36の染色と重なって黄色に見える。青はDAPIによるDNA染色。
図1

主な研究内容

○新規核内タンパク質群の同定とナノスケール解析による核内動態の解明

・モノクローナル抗体(Mab)の抗原検索と同定
HeLa細胞核抽出画分を用いて、ヒト分裂期クロマチンを抗原として作成されたMabの抗原の検索と同定を行う。この結果と抗体染色像を結びつけ、核内構造タンパク質の網羅的データベースを構築する。

・HeLa細胞核マトリックス画分タンパク質の網羅的解析
HeLa細胞核マトリックス画分タンパク質をＰＭＦ法とＰＳＴ法で独立にプロテオーム解析し、それぞれ６種類と４０種類の新規タンパク質を同定した。今後新規タンパク質のＧＦＰ融合タンパク質の発現とＦＲＡＰ解析及びＲＮＡｉ解析を進め、これらのタンパク質の核内における動態を明らかにし、核内部の基盤構造を解明する。

・ISP36の構造、動態、機能の解析
核内構造タンパク質の例としてISP36を取り上げ詳細に解析する。ISP36は、ラット肝核不溶性画分のプロテオーム解析で見出した新規タンパク質でクロマチン間コンパートメントを充たすように存在する興味あるタンパク質である（図１）。最近Yeast-two-hybrid法で１２種類のタンパク質が結合することを見出した。またISP36のジーンターゲティングヒト培養細胞も作成できたので、これを用いてISP36の複合体を明らかにし、それらの複合体をAFMで解析する。そしてこれらの結果からこのタンパク質の核内動態と機能を明らかにする。

○研究に応用可能な新しいナノスケール解析法の開発と細胞核構造構築メカニズムの解明への応用

・核膜蛋白質の細胞周期依存的な翻訳後修飾の解析
細胞周期依存的なリン酸化・脱リン酸化による核膜・クロマチン結合の調節機構をカエル卵抽出液の系で解析してきたがこの研究をさらに進め、核膜前駆小胞のクロマチンへのターゲティングの分子機構を明らかにする。

・核膜・クロマチン間ドメイン・クロマチンのネットワークのin vitro再構成とＡＦＭによる解析

・核膜再構成の種々の中間体の形成とAFMによる解析


研究室メンバー
石井　宏平（Ｄ２）堀　　嘉仁（Ｍ２）地濃　宏晃（Ｍ２）井原　詠子（Ｍ１）岩瀬　由佳（Ｍ１）松岡美紗子（Ｍ１）荒貴　七星（Ｂ４）

最近の研究成果
[本研究の基礎となるもの] cDNA cloning of nuclear localization signal binding protein NBP60, a rat homologue of lamin B receptor, and identification of binding sites of human lamin B receptor for nuclear localization signals and chromatin. 　　Shigeru Kawahire, Masaki Takeuchi, Takashi Gohshi, Saroru Sasagawa, Midori Shimada, Minako Takahashi, Takako K. Abe, Takayuki Ueda, Ryozo Kuwano, Akihisa Hikawa, Tohru Ichimura, Saburo Omata, and Tsuneyoshi Horigome (1997) J. Biochem.121, 881-889 Reversed-phase high-performance liquid chromatography of membrane proteins on perfusion-type polystyrene resin columns in 60 % formic acid.　　Noriko Kikuchi, Yoshio Yamakawa, Tohru Ichimura, Saburo Omata, and Tsuneyoshi Horigome (1997) Chromatography 18, 176-184 In vitro nuclear assembly with affinity-purified nuclear envelope precursor vesicle fractions, PV1 and PV2. Satoru Sasagawa, Akitsugu Yamamoto, Tohru Ichimura, Saburo Omata, and Tsuneyoshi Horigome (1999) Eur. J. Cell Biol.78, 593-600 The binding of lamin B receptor to chromatin is regulated by phosphorylation in the RS region. Makoto Takano, Masaki Takeuchi, Hiromi Ito, Kazuhiro Furukawa, Kenji Sugimoto, Saburo Omata and Tsuneyoshi Horigome (2002) Eur. J. Biochem. 269, 943-953 Profile and clinical significance of anti-nuclear envelope antibodies found in patients with primary biliary cirrhosis: a multicenter study. Kiyomitsu Miyachi, Raleigh W. Hankins, Hiroshi Matsushima, Futoshi Kikuchi, Tetsushi Inomata, Tsuneyoshi Horigome, Minoru Shibata, Yasushi Onozuka, Yukihisa Ueno, Etsuko Hashimoto, Naoaki Hayashi, Akitaka Shibuya, Shuichi Amaki, Hirosih Miyakawa (2003) J. Autoimmunity 20, 247-254 Participation of a fusogenic protein, glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase, in nuclear membrane assembly. Tomoaki Nakagawa, Yasuhiro Hirano, Akira Inomata, Sadaki Yokota, Kiyomitsu Miyachi, Mizuho Kaneda, Masato Umeda, Kazuhiro Furukawa, Saburo Omata, and Tsuneyoshi Horigome (2003) J. Biol. Chem. 278, 20395-20404 [2004以降] Regulation of binding of lamin B receptor to chromatin by SR protein kinase and cdc2 kinase in Xenopus egg extracts. Makoto Takano, Yuhei Koyama, Hiromi Ito, Satomi Hoshino, Hiroshi Onogi, Masatoshi Hagiwara, Kazuhiro Furukawa and Tsuneyoshi Horogome (2004) J. Biol. Chem. 279, 13265-13271 Autoantibodies from primary biliary cirrhosis patients with anti-p95c antibodies bind to recombinant p97/VCP and inhibit in vitro nuclear envelope assembly. K. Miyachi, Y. Hirano, T. Horigome, T. Mimori, H. Miyakawa, Y. Onodera, M. Shibata, M. Hirakata, A. Suwa, H. Hosaka, S. Matsushima, T. Komatsu, H. Matsushima, R. W. Hankins, and M. J. Fritzer (2004) Clin. Exp. Immunol. 136, 568-573 Proteome analysis of rat liver nuclear insoluble protein fraction and localization of a novel protein, ISP36, to compartments in the interchromatin space. M. Segawa, K. Niino, R. Mineki, N. Kaga, K. Murayama, K. Sugimoto, Y. Watanabe, K. Furukawa, and T. Horigome (2005) FEBS J. 272, 4327-4338 Null mutants of Drosophila B-type lamin Dm0 show aberrant tissue differentiation rather than obvious nuclear shape distortion or specific defects during cell proliferation. S. Osouda, Y. Nakamura, B. de Saint Phalle, M. McConnell, T. Horigome, S. Sugiyama, P. A. Fisher, and K. Furukawa (2005) Dev. Biol. 284, 219-232 Dissociation of emerin from barrier-to-autointegration factor is regulated through mitotic phosphorylation of emerin in a Xenopus egg cell-free system. Yasuhiro Hirano, Masashi Segawa, Fumiko S. Ouchi, Yoshio Yamakawa, Kazuhiro Furukawa, Kunio Takeyasu and Tsuneyoshi Horigome (2005) J. Biol. Chem. 280, 39925-39933 Anti-p97/VCP antibodies: an autoantibody marker for a subset of primary biliary cirrhosis patients with milder disease? Kiyomitsu Miyachi, Hiroo Hosaka, Noriko Nakamura, Hiroshi Miyakawa, Tsuneyo Mimori, Minoru Shibata, Shouzoh Matsushima, Hiroaki Chinoh, Tuneyoshi Horigome, Raleigh W. Hankins, Meifeng Zhang, Marvin J. Fritzler (2006) Scand. J. Immun. 63, 376-382 Nuclear envelope precursor vesicle targeting to chromatin is stimulated by　protein phosphatase 1 in Xenopus egg extracts. Hiromi Ito, Yuhei Koyama, Makoto Takano, Kohei Ishii, Mitsugu Maeno, Kazuhiro Furukawa, and Tsuneyoshi Horigome (2007) Exp. Cell Res. 313, 1897-1910 BAF as a Caspase-Dependent Mediator of Nuclear Apoptosis in Drosophila. Tomoko Aida, Yuki Nonaka, Shinichi Osoda, Candido Juarez, Tsuneyoshi Horigome, Shin Sugiyama, and Kazuhiro Furukawa (2007) J. Struct. Biol. In press

総説・解説等
Autoantigens of the nuclear pore complex.Paul Enarson, J. B. Rattner, Young Ou, Kiyomitsu Miyachi, Tsuneyoshi Horigome and Marvin Fritzler (2004) J. Mol. Med. 82, 423-433 細胞核のプロテオーム解析　堀米恒好、石井宏平、古川和広　(2006) 「蛋白質核酸酵素」増刊号　細胞核の世界　米田悦啓他編　51, pp2013-2019共立出版　核脂質膜と核ラミナ　古川和広、襲田眞一、堀米恒好、(2006) 「蛋白質核酸酵素」増刊号　細胞核の世界　米田悦啓他編　51, pp1931-1936 共立出版　核膜病　古川和広、野中由喜、堀米恒好 (2006)「蛋白質核酸酵素」増刊号　細胞核の世界　米田悦啓他編　51,pp2263-2268 共立出版

著書
再構成核による核膜の再構成機構の解析(2004)堀米恒好、古川和広　細胞核のダイナミクス　竹安邦夫・米田悦啓編　pp87-94 シュプリンガー・フェアラーク東京核膜の分子と機能(2004)古川和広、襲田真一、堀米恒好　細胞核のダイナミクス　竹安邦夫・米田悦啓編　pp187-194シュプリンガー・フェアラーク東京 Dynamics, roles, and diseases of the nuclear membrane, lamins and lamina-binding proteins, in Nuclear dynamins: approaches from molecular, biochemical and visual biology. (Kunio Takeyasu and Kyosuke Nagata eds.) Tsuneyoshi Horigome, Yasuhiro Hirano and Kazuhiro Furukawa (2007) pp 123-143 Springer-Verlag, Tokyo Purification and proteomic analysis of the nuclear insoluble protein fraction, in Organelle Proteomics. (Pflieger and Rossier eds.) Tsuneyoshi Horigome, Kazuhiro Furukawa and Kouhei Ishii (2007) Humana Pressin pres