特定の核ドメインにおける転写制御の詳細な分子機構を解明するためには、生体内における核の特定の場所で起きる転写活性化を検出することが必要である。しかしながら、従来の生化学的な手法では困難であった。そこで本研究は、細胞を生きたままの状態で細胞内のヒストンのアセチル化を検出することの出来るFRETを原理とした蛍光プローブの開発を行うことを目的とした。アセチル化ヒストンを検出する蛍光プローブを作製するために、FRETを起こす蛍光ドナー蛋白質であるCFPにヒストンH4を連結した蛋白質と蛍光アクセプター蛋白質であるYFPにアセチル化ヒストンH4結合蛋白質を連結した蛋白質をリンカーで結ぶことによって、アセチル化依存的に分子内でFRET変化を起こすヒストンH4アセチル化の蛍光プローブを作製した。作製した蛍光プローブは、内在性のヒストンH4と同様にクロマチン内に取り込まれていること、ヒストン脱アセチル化阻害剤であるトリコスタチンA（TSA）処理は、内在性のヒストンH4と同様なタイムコースで蛍光プローブのアセチル化を誘導し、FRET変化が起きることを確認した。さらに、この蛍光プローブを用いて、有糸分裂過程におけるヒストンH4のアセチル化状態を観察したところ、染色体が凝集するとともにヒストンH4の脱アセチル化が起こり、分裂終期の後半には分裂前のアセチル化状態まで回復することが分かった。以上の結果から、作製した蛍光プローブは生細胞内で内在性のヒストンH4と同様の挙動を示し、蛍光プローブのアセチル化はFRET変化に伴う蛍光強度比変化として検出可能であることが示され、アセチル化ヒストンを検出する蛍光プローブの開発に成功した。

発表論文リスト：

1. Ueoka, R., Ito, A., Izumikawa, M., Maeda, S., Takagi, M., Shin-ya, M., Yoshida, M., Soest, R.V., and Matsunaga, S.;Isolation of azaspiracid-2 from a marine sponge Echinoclathria sp. as a potent cytotoxin., Toxicon (2009) in press
2. Fukuda, I., Ito, A.*, Uramoto, M., Saitoh, H., Kawasaki, H.,Osada, H., Yoshida, M.,Kerriamycin B inhibits protein SUMOylation., J. Antibiotics (2009) in press*corresponding author
3. Fukuda, I., Ito, A.*, Hirai, G., Nishimura, S., Kawasaki, H., Saitoh, H., Kimura, K., Sodeoka, M., and Yoshida, M., Ginkgolic acid inhibits protein SUMOylation by blocking formation of the E1-SUMO intermediate., Chem. Biol. (2009) in press*corresponding author
4. 伊藤昭博、前田里子、吉田稔：　HAT活性・HDAC活性測定　実験医学別冊　エピジェネティクス実験プロトコール　167-80　(2008)
5. Dohi, Y., Ikura, T., Hoshikawa, Y., Katoh, Y., Ota, K., Nakanome, A., Muto, A., Omura, S., Ohta, T., Ito, A., Yoshida, M., Noda, T., and Igarashi, K.: Bach1 inhibits oxidative stress-induced cellular senescence by impeding p53 function on chromatin. Nature Str. Mol. Biol., 12: 1246-54 (2008)
6. Kamemura K., Ito A.*, Shimazu T., Matsuyama A., Maeda S., Yao T.P., Horinouchi S., Khochbin S., & Yoshida M.: Effects of downregulated HDAC6 expression on the proliferation of lung cancer cells.Biochem Biophys Res Commun., 374: 84-9 (2008)*corresponding author
7. 伊藤昭博、吉田稔: アセチル化 分子細胞治療 6: 16-22 (2007)
8. Ito A., Nishino N. & Yoshida M.: HDAC inhibitors: discovery, development, and clinical impacts. Histone Deacetylases: Transcriptional Regulation and Other Cellular Functions 271-297 (2006)
9. Kawaguchi Y., Ito A., Appella E. & Yao T. P.: Charge modification at multiple C-terminal lysine residues regulates p53 oligomerization and its nucleus-cytoplasm trafficking. J. Biol. Chem., 281: 1394-400 (2006)
10. 古米亮平、伊藤昭博、吉田稔: エピジェネティックス制御化合物と創薬　実験医学増刊　ゲノムワイドに展開するエピジェネティックス医科学　220-225 (2006)
11. 伊藤昭博、吉田稔: タンパク質アセチル化の解析　実験医学別冊　タンパク質の翻訳後修飾解析プロトコール　154-157 (2006)
12. 佐々木和樹、吉田稔：ヒストン修飾酵素　蛋白質核酸酵素別冊　51: 2069-75 (2006)
13. Saji S, Kawakami M, Hayashi S, Yoshida N, Hirose M, Horiguchi S, Ito A, Funata N, Schreiber SL, Yoshida M, & Toi M.: Significance of HDAC6 regulation via estrogen signaling for cell motility and prognosis in estrogen receptor-positive breast cancer. Oncogene, 24: 4531-4539 (2005)