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文部科学省科学研究費補助金「特定領域研究」細胞核ダイナミクス
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細胞核の高次構造動態：ナノスケールイメージングによる解明
平成１６−２０年度
しきり線
研究代表者：京都大学大学院生命科学研究科　竹安邦夫
研究分担者：京都大学大学院生命科学研究科　吉村成弘
研究分担者：新潟大学理学部化学科　堀米恒好
 

●モノクローナル抗体の抗原検索

動態解明のための道具をそろえるため、細胞核質、核マトリックスおよび分裂期クロマチンに対するモノクローナル抗体ギャラリーを作成し、核内および分裂期染色体上の染色パターンを確定し、その結果をホームページ上にアップした（竹安）。これらのモノクローナル抗体に対する抗原を検索し、21種類の抗体に対する抗原を決定した（竹安、堀米）。それらの中には、新規タンパク質であるJmjCドメインタンパク質に対するものを含む核小体特異的抗体12種類の他、核内にあるサイトケラチン18のみを特異的に染色する抗体、核内にあるαアクチニン4のみを特異的に染色する興味ある抗体も含まれていた。

●核研究に応用可能な新しいナノスケール解析法の開発：
（１）高速AFMの応用法の確立を目指し、酵素とDNAとの反応機構の解明に、また、GroEL/ES のATP/ADP存在下での反応機構の解明に成功した。本装置は世界で唯一の「液中での生体試料観察が可能な高速原子間力顕微鏡」である。
（２）GSH-ポリエチレングリコールリンカーを用いた「AFM−カンチレバーの修飾法」を確立した。この系を用いて、核膜孔複合体とインポーチンとの間の力学測定に成功した。また、ラミンB受容体とクロマチンとの結合力も測定した。
（３）ラミンB受容体とクロマチンとの結合の解析において、ピコトレックモードを用いて、AFM画像とその画像上でのラミンB受容体の結合部位の情報を同時取得する方法（Recognition Imaging 法）を確立した。

●細胞核マトリックス画分のプロテオーム解析を基にした核内構造の解析

核内構造に寄与するタンパク質が多く含まれている細胞核マトリックス画分の構成タンパク質を３回（ラット肝１回とHeLa細胞２回）のプロテオーム解析で網羅的に調べ、１）２８（このうち新規タンパク質１）、８３（５）及び３３３（３９）種のタンパク質を同定し、データベースにして公開した。２）この画分は、ゲノム全体と比べて、しばしば超タンパク質複合体の骨格タンパク質として見出される、ＷＤ repeatsを持つタンパク質とdisordered 領域を多く含むタンパク質（DOタンパク質）を高率で含むことを明らかにした。また、３）機能未知タンパク質BXDC1とEBNA1BP2の機能と動態を解析し、これらのタンパク質がリボソーム形成においてdynamic scaffoldとして働いていることを明らかにした。４）これらの結果を基に新しい核マトリックス構造モデルとして”Dynamic scaffold-based model”を提案した（堀米、竹安）。

図

●新規核内タンパク質の機能・動態解析

機能未知核マトリックスタンパク質でDOタンパク質の一種であるISP36の機能解析のためYeast two hybrid法を行い（堀米）、１）１２種類の結合タンパク質を検出したがその多くはシグナリングに関係するタンパク質であった。２）そのうち調べた５種はいずれも一部はISP36の核内スペックルと共局在した。３）FRAP法により、ISP36の動きは通常の核内タンパク質よりかなり遅いことが示された。４）これらの結果よりISP36は、核内のクロマチン間にあって情報伝達分子超分子複合体のdynamic scaffoldとして働いていることが示唆された。さらに、機能未知の核小体タンパク質であるBXDC1、EBP2、NO66は、核小体内において特徴的にモビリティーが遅く、難溶性であり、また分裂期にも特徴的な動態を示すことが明らかになった（竹安、堀米）。

●核膜タンパク質の細胞周期依存的な翻訳後修飾の解析

アフリカツメガエル卵抽出液の系での解析により、１）核膜内膜タンパク質のラミンＢ受容体(LBR)とエメリンの分裂期におけるリン酸化を詳細に調べ、クロマチンからの解離機構を明らかにした。また、２）核膜再構成時のクロマチン表面への核膜の集積にLBRが寄与し、またタンパク質リン酸化酵素１が重要な働きをしていることを明らかにした（堀米）。また、エメリンとの機能的相同性が示唆され、かつヒトから線虫まで保存されているMAN1の細胞周期依存的リン酸化状態の解析を行った（竹安、堀米）。MAN1は、N末端領域（MAN1-N、1-471残基）、C末端領域（MAN1-C、651-911残基）の二つの核質領域を持つ。MAN1-Nは合成期、分裂期ともリン酸化され、MAN1-Cは分裂期のみ弱くリン酸化された。In vitroのBAF結合実験から、MAN1-Nの分裂期におけるリン酸化が、MAN1-NとBAFの結合を抑制することが明らかになった。
 

発表論文リスト（抜粋）：
竹安・吉村研究室
原著論文

  1. S.H. Yoshimura, H. Maruyama, F. Ishikawa, R. Ohki & K. Takeyasu  (2004) Molecular mechanisms of DNA end-loop formation by TRF2. Genes to Cells., 9: 205-218.
  2. K. Takeyasu, J. Kim, R.L. Ohniwa, Y. Inose, K. Morikawa, T. Ohta, A. Ishihama & S.H. Yoshimura (2004) Genome architecture studied by nano-scale imaging: Analyses among bacterial phyla and their implication to the eukaryotic genome folding.Cytogenet Genomes Res107: 38-48.
  3. T. Nakai, K. Hizume, S.H. Yoshimura,K. Takeyasu & K. Yoshikawa (2005) Phase transition in reconstituted chromatin. Europhysics Letters. 69(6): 1024-1030.
  4. K. Hizume, S.H. Yoshimura & K. Takeyasu (2005) Linker histone H1 per se can induce three-dimensional folding of chromatin fiber. Biochemistry, 44: 12978-12989.
  5. T. Kobori, M. Kodama, K. Hizume, S.H. Yoshimura, T. Ohtani & K. Takeyasu (2006) Comparative structural biology of the genome: Nano-scale imaging of single nucleus from different kingdoms reveals the chromatin built up on a 40 nm structural unit. J. Electron Microscopy, 55: 31-40.
  6. D. Liu, N. Zhang, J. Du, X. Cai, M. Zhu, C. Jin, Z. Dou, C. Feng, Y. Yang, L. Liu, K. Takeyasu, W. Xie & X. Yao (2006) Interaction of Skp1 with CENP-E at the midbody is essential for cytokinesis. Biochem. Biophys. Res. Commun., 345: 394-402.
  7. M. Yokokawa, S.H. Yoshimura, Y. Naito, T. Ando, A. Yagi, N. Sakai & K. Takeyasu (2006) Fast-scanning atomic force microscopy revealed the molecular mechanism of DNA cleavage by ApaI endonuclease. IEE Proc. Nanobiotechnology, 153: 60-66.
  8. M. Yokokawa, C. Wada, T. Ando, N. Sakai, A. Yagi & K. Takeyasu (2006) Single-molecule reaction analysis reveals the ATP-ADP-dependent conformational changes of chaperonin GroEL. EMBO J., 25: 4567-4576.
  9. Y. Hirano, R.L. Ohniwa, C. Wada, S.H. Yoshimura & K. Takeyasu (2006) Human small G proteins, ObgH1 and ObgH2, participate in the maintenance of mitochondria and nucleolar architectures. Genes Cells, 11: 1295-1304.
  10. R.L. Ohniwa, K. Morikawa, J. Kim, T. Ohta, A. Ishihama, C. Wada & K. Takeyasu (2006) Dynamic state of DNA topology is essential for genome condensation in baceteria. EMBO J., 25: 5591-5602.
  11. S.H. Yoshimura, H. Takahashi, S. Ohtsuka & K. Takeyasu (2006) Development of glutathione-coupled cantilever for the single-molecule force measurement by scanning force microscopy. FEBS Lett., 580: 3961-3965.
  12. C. Das, K. Hizume, K. Batta, B.R.P. Kumar, S.S.Gadad, S. Ganguly, S. Lorain, A. Verreault, P..P. Sadhale, K. Takeyasu & T.K. Kundu (2006) Transcriptional co-activator PC4, a chromatin-associated protein, induces chromatin condensation. Mol. Cell. Biol.,26: 8303-8315.
  13. R.L. Ohniwa, K. Morikawa, J. Kim, T. Kobori, K. Hizume, R. Matsumi, H. Atomi, T. Imanaka, T. Ohta, S.H. Yoshimura &K. Takeyasu (2006) Atomic force microscopy dissects the hierarchy of genome architectures in eukaryote, prokaryote and chloroplast. Microscopy and Microanalysis, 13: 3-12.
  14. T. Kobori, S. Iwamoto, K. Takeyasu, & T. Ohtani (2007) Chromatin dynamics of unfolding and refolding controlled by the nucleosome repeat length and the linker and core histones. Biopolymers, 85: 295-307.
  15. K. Hizume, S. Araki, K. Yoshikawa & K. Takeyasu (2007) Topoisomerase II, a scaffold component, promotes chromatin-compaction in vitro in a linker-histone H1-dependent manner. Nucleic Asid Res., 35: 2787-2799.
  16. Crampton N, Yokokawa M, Dryden DT, Edwardson JM, Rao DN, Takeyasu K,Yoshimura SH, & Henderson RM (2007). Fast-scan atomic force microscopy reveals that the type III restriction enzyme EcoP15I is capable of DNA translocation and looping. Proc Natl Acad Sci USA 104: 12755-12760.
  17. Y. Hirano, H. Takahashi, M. Kumeta, K. Hizume, Y. Hirai, S. Otsuka, S.H. Yoshimura & K. Takeyasu (2008) Nuclear Architectures and Chromatin Dynamics Revealed by Atomic Force Microscopy in Combination with Biochemistry and Cell Biology. Eur. J. Physiol., 456: 139-153.
  18. M. Yokokawa, K. Takeyasu and S.H. Yoshimura (2008) Scanning probe microscope revealed mechanical properties of plasma membrane and nuclear envelope in living cells. J. Microscopy 232: 82-90.
  19. S. Otsuka, S. Iwasaka, Y. Yoneda, Takahashi, K. Takeyasu and S.H. Yoshimura (2008) Individual binding pockets of importin β for FG-nucleoporins have different binding properties and different sensitivities to RanGTP.Proc Natl Acad Sci USA, 105: 16101-16106.
  20. Y. Hirano, Y. Iwase, K. Ishii, M. Kumeta, T. Horigome & K. Takeyasu (2009) Cell Cycle-Dependent Phosphorylation of MAN-1. Biochemistry, (In Press).
  21. K. Hizume, T. Nakai, S. Araki, E. Prieto, K. Yoshikawa & K. Takeyasu (2009) Removal of histone tails from nucleosome dissects the physical mechanisms of salt-induced aggregation, linker histone H1-induced compaction and 30-nm fiber formation of the nucleosome array.Ultramicroscopy, (In Press).

総説

  1. 小堀俊郎、横川雅俊、竹安邦夫 (2004) 原子間力顕微鏡―ナノバイオロジーへの架け橋―. 生物物理44: 255-259
  2. S. Otsuka, H. Takahashi, K. Takeyasu and S.H. Yoshimura (2006) Single-molecule structural and functional analyses of nuclear pore complex. IEEE Proceedings of the 2006 International Symposium on Micro-NanoMechatronics and Human Science.
  3. K. Takeyasu, K. Hizume, T. Kobori, M. Kodama, R.L. Ohniwa & S.H. Yoshimura (2006) AFM elucidates genome architectures where reconstitution of chromatin fibers and dissection of nuclear chromain meet. Proceedings of the VII. Linz Winter Workshop, 111-116.
  4. S. Otsuka, H. Takahashi, K. Takeyasu and S.H. Yoshimura (2006) Molecular Mechanism of protein transport across nuclear membrane. Recent Res. Devel. Biophys. 5, ptII: 245-256.
  5. S. Otsuka, Y. Hirano, H. Takahashi, M. Kumeta, K. Takeyasu and S. H. Yoshimura (2007) Single-Molecule Imaging, Force Measurement and Fluorescence Observation Reveal Protein and Chromosome Dynamics around the Nuclear Envelope. in IEEE Proceedings of the 2007 International Symposium on Micro-NanoMechatronics and Human Science. (electric publication)
  6. 吉村成弘，竹安邦夫(2007)　細胞核のナノバイオロジー。ケミカルエンジニヤリング 52(7): 511-520

著書（単行本）

  1. 「ナノバイオロジー」（2004）竹安邦夫　編著　共立出版
  2. 「細胞核のダイナミズム」（2004）竹安邦夫・米田悦啓（共編著）シュプリンガー
  3. “Nuclear Dynamics: Approaches from Biochemistry, Molecular Biology and Visual Biology” (2006) K. Takeyasu & K. Nagata (Eds) Springer Verlag

堀米研究室
原著論文

  1. Homogeneous assays for single-nucleotide polymorphism genotyping: Exo-proofreading assay based on loop-mediated isothermal amplification.Kuzuhara, Y., Yonekawa, T., Iwasaki, M., Kadota, T., Kanda, H., Horigome, T. and Notomi, T.(2005) Yokohama Med. J. 56, 9-16
  2. Proteome analysis of rat liver nuclear insoluble protein fraction and localization of a novel protein, ISP36, to compartments in the interchromatin space.Segawa, M., Niino, K., Mineki, R., Kaga, N., Murayama. K., Sugimoto, K., Watanabe, Y., Furukawa, K. and Horigome, T.(2005) FEBS J. 272, 4327-4338
  3. Null mutants of Drosophila B-type lamin Dm0 show aberrant tissue differentiation rather than obvious nuclear shape distortion or specific defects during cell proliferation.Osouda, S., Nakamura, Y., de Saint Phalle, B. McConnell, B., Horigome, T., Sugiyama, S., Fisher, P.A. and Furukawa, K.(2005) Dev. Biol. 284, 219-232
  4. Dissociation of emerin from barrier-to-autointegration factor is regulated through mitotic phosphorylation of emerin in a Xenopus egg cell-free system.Hirano, Y., Segawa, M., Ouchi, F. S., Yamakawa, Y., Furukawa, K., Takeyasu, K. and Horigome, T.(2005) J. Biol. Chem. 280, 39925-39933
  5. Anti-p97/VCP antibodies: an autoantibody marker for a subset of primary biliary cirrhosis patients with milder disease Miyachi, K., Hosaka, H., Nakamura, N., Miyakawa, H., Mimori, T., Shibata, M., Matsushima, S., Chinoh, H., Horigome, T., Hankins, W. R., Zhang, M., and Fritzler, J. M.(2006) Scand. J. Immun. 63, 376-382
  6. Nuclear envelope precursor vesicle targeting to chromatin is stimulated by protein phosphatase 1 in Xenopus egg extracts.Ito, H., Koyama, Y., Takano, M., Ishii, K., Maeno, M., Furukawa, K. and Horigome, T.(2007) Exp. Cell Res. 313, 1897-1910
  7. BAF as a Caspase-Dependent Mediator of Nuclear Apoptosis in Drosophila.Kazuhiro Furukawa, Tomoko Aida, Yuki Nonaka, Shinichi Osoda, Candido Juarez, Tsuneyoshi Horigome, Shin Sugiyama.(2007) J Struct. Biol.160, 125-134
  8. Nuclear matrix contains novel WD-repeat and disordered-region-rich proteins.Kohei Ishii, Yasuhiro Hirano, Nanase Araki, Toshiyuki Oda, Masahiro Kumeta, Kunio Takeyasu, Kazuhiro Furukawa, and Tsuneyoshi Horigome. (2008) FEBS Lett. 582, 3515-3519
  9. Proteomic and targeted analytical identification of nuclear matrix-residing BXDC1 and EBNA1BP2 as dynamic scaffold proteins in the nucleolus.Yasuhiro Hirano, Kohei Ishii, Masahiro Kumeta, Kazuhiro Furukawa, Kunio Ktakeyasu , and Tsuneyoshi Horigome.(2009) Genes Cells in press
  10. A-type and B-type lamins initiate layer assembly at distinct areas of the nuclear envelope in living cells. Kazuya Ishida, Taka-aki Tsunoyama, Suguru Toda, Shinichi Osoda, Tsuneyoshi Horigome, Paul A Fisher, Shin Sugiyama, and Kazuhiro Furukawa (2009) Exp. Cell Res. in press
  11. Cell cycle-dependent phosphorylation of MAN1. Yasuhiro Hirano, Yuka Iwase, Kohei Ishii, Masahiro Kumeta, Tsuneyoshi Horigome, and Kunio Takeyasu(2009) Biochemistry in press

著書

  1. 再構成核による核膜の再構成機構の解析細胞核のダイナミクス堀米恒好、古川和広　(竹安邦夫・米田悦啓編)pp87-94 シュプリンガー・フェアラーク東京　(2004)
  2. Dynamics, roles, and diseases of the nuclear membrane, lamins and lamina-binding proteins, in Nuclear dynamins: approaches from molecular, biochemical and visual biology.Horigome, T., Hirano, Y. and Furukawa, K.(Takeyasu, K.and Nagata, K. eds.) pp 123-143 Springer-Verlag, Tokyo (2007)
  3. Purification and proteomic analysis of the nuclear insoluble protein fraction, in Organelle Proteomics.Horigome, T., Furukawa, K. and Ishii, K. (Pflieger and Rossier eds.) pp139-148 Humana Press (2008)

総説

  1. Autoantigens of the nuclear pore complex. Enarson, P., Rattner, J. B., Ou, Y., Miyachi, K., Horigome, T. and Fritzler, M. J. Mol. Med. 82: 423-433 (2004)
  2. 細胞核のプロテオーム解析　「蛋白質核酸酵素」増刊号　細胞核の世界　堀米恒好、石井宏平、古川和広 （米田悦啓他編）共立出版　51: pp2013-2019 (2006)
　 　 　 　 　
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