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文部科学省科学研究費補助金「特定領域研究」細胞核ダイナミクス
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核膜の構造と染色体相互作用のダイナミクス
しきり線
（独）情報通信研究機構、未来ICT研究センター　原口徳子・平岡　泰　平成１６年−２０年度
 

細胞増殖における核膜と染色体相互作用のダイナミクス

細胞増殖過程における核膜のダイナミクスを理解するため、主に生細胞蛍光イメージング法を用いて、核膜分子が染色体の周りに集合する過程を詳細に調べた。核膜タンパク質をDNA上に運んでくるタンパク質として、核膜蛋白質であるエメリン(emerin)と、DNAの双方に結合するタンパクbarrier-to-autointegration factor (BAF)に注目し解析を進めた。まず、FRAP法を用いて間期での細胞内分子運動を測定したところ、BAFは１秒当たり1〜50 μm2という自由拡散に近い速さで細胞内を動いていること、emerinやMAN1などの膜タンパク質は核膜内を並進拡散で進むことが分かった。また、２つの蛍光分子間に起こる蛍光共鳴エネルギー転移 (FRET)の測定を行い、エメリンとBAFが生きた細胞の核膜上で直接結合することを明らかにした(Shimi et al, J. Struc. Biol. 2004)。哺乳類細胞に存在するBAFはS期には核内に存在すること、RNAiを用いてBAFをノックダウンするとS期が遅延することを発見し、核内BAFは正常なS期の進行に必要であることを示した(Haraguchi et al, S. Cell Sci., 2007)。分裂期になると、核膜は一旦崩壊し、染色体分離の後に、速やかに染色体上に再形成される。我々は、この過程を解析するために、生細胞蛍光イメージング法を用いて解析を行った（Dechat et al, J. Cell Sci., 2005: Haraguchi et al, J. Cell Sci., 2008）。さらに、独自に開発した新規イメージング法としてlive CLEM法を用いて解析を行った（右図）。この方法は、生きた細胞で目的分子のダイナミクスを解析した後、同じ細胞を、電子顕微鏡で膜構造や微細構造を観察するものである。この方法によって、BAFは、核膜再形成に先だって、コア領域と呼ばれる染色体領域に結合し、immobileなポリマー構造を作ること、また、RNAiによりBAFをノックダウンすると核膜形成が遅れることから、BAFは、コア領域での核膜形成に重要な働きをすることを報告した（Haraguchi et al, J. Cell Sci., 2008）。

図1

細胞分化における核膜と染色体相互作用のダイナミクス

我々の解析により、核膜は、細胞分化に伴って、その構造を変化させることが分かってきた。哺乳類細胞では、細胞老化の過程で、核構造の変化に先立ってBAFが核膜から脱落し、細胞質に局在を変えることを発見した(Haraguchi et al, J. Cell Sci., 2007)。減数分裂という分化過程での核膜機能については、分裂酵母を用いて解析した。分裂酵母の全ゲノムにある遺伝子約4500の約３分の１にあたる1500個に対し、ゲノム上の各遺伝子に直接GFP遺伝子を融合した細胞株を作製し、うち約800個の遺伝子に対してGFP遺伝子が融合した細胞株を作製した(Hayashi et al, Genes Cells,2009)。この細胞株では、遺伝子発現は、本来のプロモータによって制御されるために、GFP融合遺伝子の過剰発現がなく、細胞内局在は現実を反映している可能性が高い。核膜に局在するタンパク質や、セントロメアやテロメアなど、染色体の特殊領域に局在するものに関して、その分子動態と機能の一端を明らかにした(Chikashige et al, Genes Cells, 2004; Ding et al, J. Cell Biol. 2006; Hayashi et al, Mol. Biol. Cell, 2006; Asakawa et al, Cell Div., 2007)。減数分裂期に発現量が増加するタンパク質をDNAマイクロアレーの結果に基づいて検索し、核膜とテロメアに結合するタンパク質としてbqt1とbqt2と名付けた新規タンパク質を同定した。遺伝学的な方法とイメージングの手法を用いて、これらのタンパク質は、減数分裂期のテロメアの移動、相同染色体組み換え、胞子形成（高等動物では精子や卵子形成に相当）に直接間接的に必須であることを証明した(Chikashige et al, Cell, 2006)。Bqt1とbqt2が揃うと、核膜タンパク質Sad1と染色体末端テロメアの両方がBqt1/bqt2を介してつながるようになる。それによって、核膜を介して、細胞質に存在する微小管上の動きがテロメアに伝わり、細胞質から核内の染色体テロメアを機械的に動かすことができることを証明した（図）。我々の発見を契機として、出芽酵母やマウス、線虫でも類似研究が行われ、これらの真核生物でも同様の仕組みがあり、核膜タンパク質が減数分裂の初期反応に重要であることが次々と発見された（Chikashige et al, Chromosoma, 2007）。この研究は、ヒトでも、核膜機能が卵子や精子のような生殖細胞を作り出す過程に重要な役割を果たす可能性を示唆するものである。

図2
 

発表論文リスト：

  1. Hiraoka Y, Kawamata, K, Haraguchi T, and Chikashige, Y. Codon usage bias is correlated with gene expression levels in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Genes Cells, In press
  2. Hayashi A, Ding, DQ, Tsutsumi C, Chikashige Y, Masuda H, Haraguchi T and Hiraoka Y Localization of gene products using a chromosomally tagged GFP-fusion library in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe Genes Cells. 14, 217-225 (2009)
  3. Nakamura T, Asakawa H, Nakase Y, Kashiwazaki J, Hiraoka Y, Shimoda C. Live observation of forespore membrane formation in fission yeast. Mol Biol Cell 19(8):3544-53. (2008)
  4. Ishii K, Ogiyama Y, Chikashige Y, Soejima S, Masuda F, Kakuma T, Hiraoka Y, Takahashi K. Heterochromatin integrity affects chromosome reorganization after centromere dysfunction. Science. 321(5892):1088-91. (2008)
  5. Yamamoto A, Kitamura K, Hihara D, Hirose Y, Katsuyama S, Hiraoka Y. Spindle checkpoint activation at meiosis I advances anaphase II onset via meiosis-specific APC/C regulation. J Cell Biol. 182(2): 277-88. (2008)
  6. Haraguchi, T, Kojidani, T, Koujin, T, Shimi, T, Osakada, H, Mori, C, Yamamoto, A and Hiraoka, Y. Live cell imaging and electron microscopy revealed dynamic processes of BAF-directing nuclear envelope assembly. J. CellSci.121, 2540-2554. (2008)
  7. Chikashige, Y., Tsutsumi, C., Okamasa, K., Yamane, M., Nakayama, J., Niwa, O., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. Gene Expression and Distribution of Swi6 in Partial Aneuploids of the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe. Cell Struct. Funct. 32(2):149-161. (2007)
  8. Chikashige, Y., Haraguchi, T., and *Hiraoka, Y. Another way to move chromosomes. Chromosoma 116(6):497-505. (2007)
  9. Furukawa,K., Aida,T., Nonaka,Y., Osouda,S., Juarez,C., Horigome,T., Sugiyama,S. BAF as a Caspase-Dependent Mediator of Nuclear Apoptosis in Drosophila. J. Struct. Biol. 160: 125-134, (2007)
  10. Hotta, T., Haraguchi, T., and Mizuno, K. A Novel Function of Plant Histone H1: Microtubule Nucleation and Continuous Plus End Association. Cell Struct. Funct. 32(2):79-87. (2007)
  11. Asakawa, H., Haraguchi, T. and Hiraoka, Y. Reconstruction of the kinetochore: a prelude to meiosis. Cell Division, 2: 17. (2007)
  12. Leach, N., Bjerke, S. L., Christenson, D. K., Bouchard, J. M., Mou, F., Park, R., Baines, J., Haraguchi, T. and Roller, R. J. Emerin is hyperphosphorylated and redistributed in herpes simplex virus type 1-infected cells in a manner dependent upon both UL34 and US3. J. Virol.81(19):10792-803. (2007)
  13. Kato, M., Kato, Y., Nishida, M., Hayakawa, T., Haraguchi, T., Hiraoka, Y., H. Inoue, Y., and Yamaguchi, M. (2007). Functional Domain Analysis of Human HP1 Isoforms in Drosophila. Cell Struct. Funct. 32, 57-67.
  14. Haraguchi, T., Koujin, T., Osakada, H., Kojidani, T., Mori, C., Masuda, H. and Hiraoka, Y. Nuclear localization of barrier-to-autointegration factor is correlated with progression of S-phase in human cells. J. Cell Sci.,120: 1967-1977. (2007)
  15. Shimanuki, M., Chung, S.-Y., Chikashige, Y., Kawasaki, Y., Uehara, L., Tsutsumi, C., Hatanaka, M., Hiraoka, Y., Nagao, K. and *Yanagida, M. (2007) Two-step, extensive alterations in the transcriptome from G0 arrest to cell division in Schizosaccharomyces pombe. Genes to Cells 12: 677-692.
  16. Haraguchi, T. and Hiraoka, Y. Breakdown and reformation of the nuclear envelope in human cells. In Nuclear Dynamics: Molecular Biology and Visualization of Nucleus. (K. Nagata, K.Takeyasu) Springer Verlag, pp. 89-106. (2007)
  17. Hayashi, A., Asakawa, H., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. Reconstruction of the kinetochore during meiosis in fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Mol Biol Cell, Dec;17(12): 5173-84. (2006)
  18. Ding, D.-Q., Sakurai, N., Katou, Y., Itoh, T., Shirahige, K., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. Meiotic cohesins modulate chromosome compaction during meiotic prophase in fission yeast. J. Cell Biol., Aug 14;174(4): 499-508. (2006)
  19. Matsuyama, A., Arai, R., Yashiroda, Y., Shirai, A., Kamata, A., Sekido, S., Kobayashi, Y., Hashimoto, A., Hamamoto, M., Hiraoka, Y., Horinouchi, S., *Yoshida, M.ORFeome cloning and global analysis of protein localization in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Nat Biotechnol., Jul 24(7): 841-847. (2006)
  20. Harigaya, Y., Tanaka, H., Yamanaka, S., Tanaka, K., Watanabe, Y., Tsutsumi, C., Chikashige, Y., Hiraoka, Y., Yamashita, A., *Yamamoto, M. Selective elimination of messenger RNA prevents an incidence of untimely meiosis. Nature, Jul 6: 442(7098):45-50. (2006)
  21. Nakase, Y., Fukuda, K., Chikashige, Y., Tsutsumi, C., Morita, D., Kawamoto, S., Ohnuki, M., Hiraoka, Y., Matsumoto, T. A defect in protein farnesylation suppresses a loss of Schizosaccharomyces pombe tsc2+, a homolog of the human gene predisposing to tuberous sclerosis complex. Genetics, 173(2): 569-78. (2006)
  22. Wang, F., Koyama, N., Nishida, H., Haraguchi, T., Reith, W., Tsukamoto, T. The Assembly and Maintenance of Heterochromatin Initiated by Transgene Repeats are Independent of the RNA Interference Pathway in Mammalian Cell. Mol. Cell. Biol, 26: 4028-4040. (2006)
  23. Chikashige, Y., Tsutsumi, C., Yamane, M., Okamasa, K., Haraguchi, T. and Hiraoka, Y. Meiotic proteins Bqt1 and Bqt2 tether telomeres to promote the bouquet arrangement of chromosomes in fission yeast. Cell, 125(1): 59-69. (2006)
  24. Masuda, H., Miyamoto, R., Haraguchi, T., and Hiraoka, Y. The carboxy-terminus of Alp4 alters microtubule dynamics to induce oscillatory nuclear movement led by the spindle pole body in Schizosaccharomyces pombe. Genes Cells, 11(4): 337-352. (2006)
  25. Masuda, H., Toda, T., Miyamoto, R., Haraguchi, T., and Hiraoka, Y. Modulation of Alp4 function in Schizosaccharomyces pombe induces novel phenotypes that imply distinct functions for nuclear and cytoplasmic γ-tubulin complexes. Genes Cells, 11(4): 319-336. (2006)
  26. Cooper, J.P. and Hiraoka, Y. Fission yeast telomeres. InTelomeres, Second edition (Titia de Lange, Vicki Lundblad, Elizabeth Blackburn, eds.) Cold Spring Harbor Laboratory Press, pp.495-523. (2006)
  27. Ding, D.-Q. and Hiraoka, Y. Genome-wide screening of intracellular protein localization in fissionyeast. In “Cell Biology” A Laboratory Handbook, Third edition vol.3 (Julio Celis, ed.)Elsevier Academic Press, pp.171-177. (2006)
  28. Nakashima, H., Nakano, M., Ohnishi, R., Hiraoka, Y., Kaneda, Y., Sugino, A. and Masumoto, H. Assembly of additional heterochromatin distinct from centromere-kinetochore chromatin is required for de novo formation of human artificial chromosome. J. Cell Sci.,118: 5885-5898. (2005)
  29. Minoshima, Y., Hori, T., Okada, M., Kimura, H., Haraguchi, T., Hiraoka, Y., Bao, Y.-C., Kawashima, T., Kitamura, T. and Fukagawa, T. The constitutive centromere component CENP-50 is required for recovery from spindle damage.Mol. Cell. Biol., 25: 10315-10328. (2005)
  30. Doll, E., Molnar, M., Hiraoka, Y., and Kohli, J. Characterization of rec15, an early meiotic recombination gene in Schizosaccharomyces pombe. Curr. Genet.,48: 323-333. (2005)
  31. Asakawa, H., Hayashi, A., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. Dissociation of the Nuf2-Ndc80 complex releases centromeres from the spindle-pole body during meiotic prophase in fission yeast. Mol. Biol. Cell, 16: 2325-2338 (2005)
  32. Oceguera-Yanez, F., Kimura, K., Yasuda, S., Higashida, C., Kitamura, T., Hiraoka, Y., Haraguchi, T. and Narumiya, S. Ect2 and MgcRacGAP regulate the activation and function of Cdc42 in mitosis. J. Cell Biol., 168: 221-232 (2005)
  33. Chikashige, Y., Ding, D.-Q., Yamamoto, A., Hayashi, A., Asakawa, H., Masuda, H., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. Genome-wide Analysis of Gene Functions. J.NICT, 51(3/4): 35-39 (2004)
  34. Haraguchi, T., Ding, D.-Q., Chikashige, Y., Yamamoto, A., Hiraoka, Y. Fluorescence Microscopy for Live Cell Imaging. J.NICT, 51(3/4): 29-33 (2004)
  35. Okamura , K., Tanaka, H., Yagita, Y., Saeki, Y., Taguchi, A., Hiraoka, Y., Zeng, L.-H., Colman, D.R. and Miki, N. Cadherin activity is required for activity-induced spine remodeling. J. Cell Biol., 167: 961-972 (2004)
  36. Dechat, T., Gajewski, A., Korbei, B., Gerlich, D., Daigle, N., Haraguchi, T., Furukawa, K., Ellenberg, J. and Foisner, R. LAP2α and BAF transiently localize to telomeres and to specific regions on chromatin during nuclear assembly. J. Cell Sci., 17: 6117-6128 (2004)
  37. Haraguchi, T. and Hiraoka, Y. Imaging Hoechst 33342-labeled chromosomes and fluorescent proteins during the cell cycle. In“Live cell imaging: A Laboratory Manual” (David Spector, ed.) Cold Spring Harbor Laboratory Press, pp. 503-511. (2004)
  38. Chikashige, Y., Kurokawa, R., Haraguchi, T. and Hiraoka, Y. Meiosis induced by inactivation of Pat1 kinase proceeds with aberrant nuclear positioning of centromeres in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Genes to Cells, 9: 671-684. (2004)
  39. Ogawa, H., Yu, R.T., Haraguchi, T., Hiraoka, Y., Nakatani, Y., Morohashi, K. and Umesono, K. Nuclear structure-associated TIF2 recruits glucocorticoid receptor and its target DNA. Biochem. Biophys. Res. Commun., 320: 218-225 (2004)
  40. Yamamoto, T.G., Chikashige, Y., Ozoe, F., Kawamukai, M. and Hiraoka, Y. Activation of the pheromone-responsive MAP kinase drives haploid cells to undergo ectopic meiosis with the normal behaviour of telomere clustering and sister chromatid segregation in fission yeast. J. Cell Sci., 117: 3875-3886 (2004)
  41. Miyamoto, Y., Saiwaki, T., Yamashita, J., Yasuda, Y., Kotera, I., Shibata, S., Shigeta, M., Hiraoka,Y.Haraguchi, T. and Yoneda, Y. Cellular stresses induce the nuclear accumulation of importin-alpha and cause a conventional nuclear import block. J. Cell Biol., 165: 617-623 (2004)
  42. Furuta, M., Kose, S., Koike, M., Shimi, T., Hiraoka, Y., Yoneda, Y., Haraguchi, T. amd Imamoto, N. Heat-shock induced nuclear retention and recycling inhibition of importin α. Genes Cells, 9: 429-441 (2004)
  43. Shimi, T., Koujin, T., Segura-Totten, M., Wilson, K.L., Haraguchi, T. and Hiraoka, Y.Dynamic interaction between BAF and emerin revealed by FRAP, FLIP and FRET analyses in living HeLa cells. J.Struct. Biol., 147: 31-41 (2004)
　 　 　 　 　
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